从头开始构建组织以探索全新的细胞结构可能会彻底改变生物学的基本理解。生物打印是一种新兴的技术，尽管通常应用于工程组织以进行治疗性组织修复或药物筛选，但生物学中存在许多生物打印的机会，例如探索细胞串扰或细胞形态发生。年新年伊始，生物材料和组织工程界大牛学者宾夕法尼亚大学JasonBurdick在Cell主刊上发表了该杂志首篇关于生物3D打印的综述，专门献给各位对生物3D打印有兴趣的生物学家（BioprintingfortheBiologist）。本综述总体目标是，在考虑生物学家的前提下提供生物打印的概述，概述挤压生物打印的步骤（使用最广泛和可实现的技术），并讨论替代性生物打印技术以及生物学中生物打印的未来机会。
背景
传统上，生物学问题是通过接种在二维（2D）硬表面（例如组织培养板，玻璃）上的细胞或动物模型进行研究的。二维培养物可以用人类细胞进行探索，但就生物物理特性和细胞组织而言是非生理性的，而动物模型对于实施和监测时空细胞行为可能具有挑战性，尤其是与人类相关性。将细胞封装在软质材料中进行三维（3D）培养正在被越来越多的使用，例如使用Matrigel特别改善了类器官内类体内集体细胞行为的培养和范围。受基质胶（Matrigel）的局限性（例如批次可变性和生化复杂性）的影响，已经开发了多种生物和合成分子的替代3D水凝胶并将其应用于细胞培养。尽管这些方法促进了生物学的发展，但它们仍常常限于单一细胞类型的统一结构和培养。
为了使细胞培养具有进一步的组织性，生物制造领域已经发展为创建模仿生物学过程的细胞构建体。这些构建体结合了活细胞和细胞外其他生化成分，并被配置为所需的结构，特别是用于组织构建体的工程化以进行转化应用，例如组织修复和药物筛选。在生物制造领域中，有许多实现技术，其中之一是生物印刷。生物打印是“利用计算机辅助技术，通过指定的2D或3D组织对生物和非生物材料进行图案化打印，以生产生物工程结构”。
生物医学研究人员可以使用的生物打印技术范围广泛。最常见且可实现的方法是挤出生物打印，其中从打印机喷嘴（有时称为打印机头）以压力驱动方式挤出生物墨水，用于打印具有用户定义设计的细丝（图1A）。喷墨印刷属于挤出生物印刷的范畴，涉及通过喷嘴而不是连续长丝的形式沉积生物油墨液滴。相比之下，光刻生物打印方法也已经出现，其中使用光在空间上将充满细胞的水凝胶树脂（生物树脂）图案化为3D构造。与挤出生物打印相比，这些技术可提供更高的分辨率。基于细胞球体的生物打印技术（通常称为生物组装）也已经出现，可以将细胞聚集体精确地组装成细胞密集的3D构造或包含类器官的结构。使用的生物打印方法取决于生物学问题以及关于复杂性，分辨率和细胞性的必要考虑。
图1挤出式生物3D打印工艺示意图
关于挤出生物打印，生物墨水通常可以描述为``适合通过自动化生物制造技术处理的细胞制剂。该领域的共同点是生物墨水是一种含有单细胞悬浮液或细胞聚集体的水凝胶制剂。该生物墨水还可以与无细胞生物材料墨水结合使用，这些墨水是结构性的（以帮助支持印刷的构造物稳定性）或牺牲性的（即它们仅在加工过程中暂时存在）。此外，尽管生物印刷通常涉及将生物墨水沉积到具有通过印刷细丝的分层而构建的3D结构的表面上，但新兴的技术引起了人们的极大兴趣，是将生物墨水沉积到了悬浮液中（也称为悬浮介质或支持水凝胶）印刷过程中的支撑（图1B）。这项技术可以挤压打印特定的生物墨水，例如，使用逐层方法很难打印的生物墨水。
尽管生物打印已广泛用于转化医学中的组织制造，但生物打印在解决基本生物学问题方面仍有很多机会。挤出生物打印可以跨越细胞基质，细胞可溶性因子以及驱动生物学的细胞-细胞相互作用，从而形成多种细胞形态。这可以通过选择生物墨水以及使用多种生物墨水来创建3D构建体来实现，其中生物墨水最终控制局部的细胞微环境（即生物化学和生物物理信号），而打印生物墨水的放置则控制着宏观结构和整个长度范围细胞群体。应该注意的是，复制组织的所有结构，生化和生物物理特性仍然很困难，并且简化的版本经常是生物打印的。本入门手册的目的是为生物学家提供生物打印的概述，其中定义了挤压生物打印的步骤和组成部分，回顾了使用生物打印解决生物学问题的文献，重点介绍了新兴的生物打印技术，并以对前景的展望为结尾。生物打印技术可能会在将来用于解决复杂的生物学问题。
生物打印的工艺过程
实施生物打印需要几个步骤，我们将其定义为（1）计划，（2）打印和（3）流程，这是指（1）总体打印图案和生物打印组件（例如细胞，生物墨水，生物材料墨水）的设计，（2）用适当的生物打印机打印所需的构造，以及（3）分别处理打印的结构（图2）。所有这些首先要确定感兴趣的生物学问题，这将固有地指导计划和印刷阶段的其他决策。生物学问题可能会决定印刷或接种到印刷结构上的各种细胞群，所使用的生物墨水的数量和类型，以及所需的尺寸和几何特征。在本节中，我们将以一般方式逐步进行生物打印的步骤，重点是常用的挤出生物打印技术。表S1-S4包含其他信息和资源，例如市售的生物墨水和生物打印机以及指向特定生物打印机的用户手册的链接。接下来的部分将提供许多示例，说明在生物学问题中已实施生物打印的情况。
图2生物3D打印的工艺流程
计划
1.打印设计
计划阶段是生物打印过程中非常重要的一步，包括两个重要方面：创建打印设计和选择生物墨水（图2A）。打印设计通常通过计算机辅助设计（CAD）软件进行创建，包括商业提供的或免费软件，例如FreeCAD，Solidworks，Blender，Onshape和OpenSCAD。用户可以从头开始创建新颖的设计，也可以修改现有的设计，例如从患者/组织扫描或其他用户那里。此外，许多市售的生物打印机都配备了用户友好的软件和支持团队，以帮助用户使用CAD模型。对于复杂的印刷品（例如模仿组织结构的印刷品），有许多开源资源，例如NIH3D打印交换（NIH3Dprintexchange），可提供医学和科学相关的CAD模型。一旦创建了CAD模型，就可以将其保存并上传到打印软件以创建G代码。大多数商业生物印刷商都接受CAD文件的STL文件格式，该格式将3D结构保存为三角形镶嵌，如图2A所示。开源软件（例如Repetier-Host或生物打印制造商提供的软件）用于将这些STL文件转换为G代码。G代码定义了沉积生物墨水的打印路径，并且可以指定如果使用了多种生物墨水，则整个打印过程中将使用哪些生物墨水。虽然STL文件格式对于大多数生物打印应用程序都是可以接受的，但有时仍需要将数据集直接转换为G代码的方法，以避免分辨率损失。
创建或选择打印设计时，一些重要的考虑因素包括：考虑打印设计所需的最小复杂度以及潜在的打印设置，例如所使用的针头，挤出流速和打印速度。生物打印平台也很重要，因为它可以确定对生物墨水兼容性和可达到的打印分辨率的限制（例如，在挤出过程中加热或冷却墨水的能力，最小的挤出压力）。印刷过程中的关键参数相互依赖，因此，挤压优化过程通常是迭代的。例如，在打印过程中选择的针头直径或细丝流速会告知G代码设计（打印路径，填充系数和打印速度）。针的直径会影响细丝的宽度，因此会影响印刷几何形状的最小特征尺寸。大多数商业平台都有出色的用户手册和培训计划，可以通过这些参数指导新用户，这些商业平台的选定列表可以在表S3和S4中找到。理想情况下，最好尽可能简化打印设计，以减少实验工作流程中不必要的复杂性。例如，大型复杂的设计（例如图2A中所示的肾脏模型）可能会制造出来，但会花费较长的时间进行打印，并且可能难以培养和分析。为了解决这个问题，研究人员已经将肾脏简化为合适的体外模型，以研究肾小管与脉管系统之间的串扰。成功的模型没有创建多个通道或试图概括复杂的肾脏微体系结构，而是专注于两通道设计，该设计更易于创建和分析，但仍能有效地探究实验研究问题。
2.墨水选择
生物墨水的选择是生物印刷实验工作流程规划过程中的另一个主要步骤。虽然此处提供了有关选择过程的简要概述，但许多出版物对可商购的和最先进的生物墨水都进行了出色的深入综述。生物墨水的选择基于墨水的可印刷性（例如，与打印机的兼容性，打印分辨率）以及生物墨水对细胞行为的影响。选择生物墨水的一般注意事项在图2A中进行了描述，并在表1中进行了更详细的描述。有许多可与所需细胞轻松组合的市售生物墨水（表S1概述），以及可能有用的生物材料墨水（以提供结构）或牺牲性的）和悬浮浴（表S2中概述）。
可印刷性通常与生物墨水的流变性质有关，该墨水允许在打印过程中挤出，其机制也可以使其在沉积到表面或悬浮浴中后保持稳定。传统的生物墨水是粘性溶液，在印刷过程中可能会变稀（意味着粘度会随着从喷嘴挤出过程中施加的机械剪切而降低），然后在沉积后恢复原状。在许多情况下，生物墨水将经历进一步的稳定化和交联（即凝胶化），例如用光（光交联），化学反应（混合，离子，酶促）或温度变化（热）。随着生物打印技术和方法的发展，与各种生物材料配方的相容性得到了改善，诸如使用悬浮浴的技术可以帮助处理低粘度生物墨水（图1B）。关于生物墨水的细胞相互作用，生物印刷过程可能会影响细胞活力，应从以前的报道和商业条件中获取指导，以避免在挤压过程中暴露于过大的剪切应力。每种生物墨水将对细胞呈现不同的生化和生物物理特征，并且所需的生物墨水可能与特定的细胞类型和生物学问题有关。例如，如果问题与机械生物学有关（将局部力学转换为生化信号），则应考虑可以轻松调节机械性能的生物墨水。此外，生物墨水必须为要打印的细胞类型（原代，胚胎或多能来源）提供合适的微环境。然而，细胞-水凝胶相互作用的详细描述不在本文的讨论范围之内，读者可参考已发表的其他文献。
在可能的情况下，鼓励使用市场上可买到的现成材料，因为这些产品具有流变学测试和建议的打印设置，从而限制了用户进行繁琐的故障排除和表征工作。表S2中详细列出了其中一些可用的生物墨水。如果要开发用于挤出生物打印或其他生物打印平台的定制生物墨水，请读者阅读以前的出版物，其中详细介绍了生物墨水的开发过程。其他资源也可以通过商业印刷商的制造商找到，这些制造商经常为表征特定平台的新型生物墨水提供有用的指南（表S4）。
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打印
规划过程完成后，用户可以进行打印。在以前的评论中，有各种各样的生物打印技术已得到很好的定义。在这些技术中，基于挤出的系统往往是生物打印功能最广泛的平台。挤压生物打印通过通过喷嘴分配生物墨水长丝来创建3D构造，这些喷嘴通过气压或注射泵进行控制。这些系统与各种各样的生物墨水兼容，并包括允许对上述生物墨水进行处理的各种功能（加热，冷却，曝光）（图2B）。许多系统还包括多个挤出喷头，以使用户可以在单个打印结构体中多种生物油墨。有多种商业解决方案可以使用挤出生物打印技术而无需能力或时间来构建定制系统，其中一些在表S3中进行了概述，在表S4中提供了更多详细信息。商业上可用的系统还具有重要的支持，标准化和用户社区，其成本从入门级到专家级不等，具体取决于打印分辨率，打印喷嘴数量和所包括的打印技术范围等功能。
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打印后处理
生物打印实验计划的最后一步是处理生物打印的构建体（图2C）。该步骤涉及培养和分析印刷的构建体，并且取决于所要询问的具体生物学问题。重要的考虑因素包括研究的持续时间（可能决定生物墨水和印刷结构的稳定性）以及取决于所包括的各种细胞群体的培养基配方。与生物打印过程中的先前步骤一样，用户可能必须重新访问过程的计划部分，才能根据结果或过程阶段中更新的步骤来调整生物墨水配方或打印参数。太大的构建体可能会限制营养物质向整合细胞的转运。也可能需要定制的生物反应器，以灌注生物打印结构中的通道。虽然不是本文的重点，但以前的出版物中详细介绍了有关3D细胞结构分析以及这些模型用于工业或临床用途的更多信息。
生物3D打印技术在生物学中的应用
生物打印解决了生物学问题的例子很多，尤其是使用挤压生物打印，并且还有很多机会值得探索。这些研究很大程度上是由组织发育或组织修复过程所激发的，并且涉及印刷具有空间图案化细胞群和/或生化因子的构建体。本节将为读者提供各种示例，其中已经在生物学问题中实施了生物打印，并说明了为什么生物打印比传统的制造技术有用。
研究组织发育和修复的生物打印模型
1.生化梯度
生化梯度为发育组织中的细胞分化提供时空线索。概括发展级联的时空复杂性是一个挑战，在该级联中多个信号中心短暂地出现以指导分化和形态发生。但是，生物打印对于此类应用是一种有前途的技术，因为可能在3D水凝胶中对多个生化物种进行空间图案化，然后可以在整个水凝胶中扩散以与细胞相互作用。为了研究响应可溶性因子的血管新生，将其印刷到悬浮液中以在细胞可降解水凝胶内部创建血管通道，并使用第二个通道呈现一系列生长因子的梯度（图3A）。有趣的是，当内皮细胞（EC）从通道向生化梯度方向发芽时，在弯曲位置观察到发芽增加。这项研究突出了生物打印技术如何用于探索如何在复杂的几何背景下解释生化信号，从而影响生物过程，例如集体细胞迁移。此外，这种几何上复杂的通道（例如，引入曲率，创建互连的通道网络）对于其他更传统的方法（例如，牺牲模制）将具有挑战性。形态发生梯度的组合阵列也是可能的，其中传统技术仅限于单个梯度。
图3研究组织发育和修复的生物打印模型
2.生物物理形态发生
在发育过程中，随着组织的生长和扩张，会产生内部和界面压力以及张力，这会导致机械不稳定，例如折叠和屈曲。这些形状变形事件通过机械转导介导的细胞规格和细胞外基质（ECM）重塑而有助于组织构图。使用传统的体外培养方法重建组织形态发生的生物物理模型具有挑战性。然而，充满细胞的生物墨水提供了一种有前途的方法，可以在空间上控制细胞产生的力和ECM机理。使用悬浮浴中的印刷将载有成纤维细胞的胶原蛋白生物墨水挤出到颗粒状支持浆液中，然后测量由于细胞对胶原蛋白的牵引而导致的细丝几何形状随时间的变化。通过改变灯丝的长度和直径，以及生物墨水和悬浮浴的力学原理，观察到一系列机械变形，包括屈曲，轴向收缩，破坏和总静态稳定性（图3A）。该平台具有巨大的潜力，可用于研究多种细胞类型中3D的生物物理形态发生，而生物打印技术所提供的设计灵活性允许研究形态发生过程中几何特征的产生方式。与模制水凝胶的传统方法（例如胶原蛋白，血纤蛋白）相比，这种方法具有设计自由和几何特征可控的优点。
3.旁分泌信号与共培养
在组织发育过程中，细胞通过旁分泌信号通过几个高度保守的受体和途径进行通讯。生物印技术为体外研究旁分泌信号提供了一个有前途的平台，因为可以使用仿生图案在3D矩阵中将多个细胞群分隔开，这对于使用传统细胞培养方法可能是一项挑战。在肝脏发育的背景下，肝细胞和内皮细胞已被印成具有仿生异源细胞定位的小叶状几何体，与缺乏几何结构的共培养相比，导致成熟度提高。生物打印可以控制不同的细胞群，以研究旁分泌信号传导，这对于传统方法（例如Transwell插入物，顺序微成型）而言是具有挑战性或不可能的。
生物打印病理模型
1.肿瘤模型
离体癌症模型有助于个性化药物治疗方案的设计和理解疾病基础的基本生物学。但是，在体外重现癌症环境的复杂性（包括基质和免疫相互作用，血管生成和ECM重塑）对传统培养方法具有挑战性。特别是，众所周知，癌细胞对化疗药物的耐药性是通过与周围基质细胞和免疫细胞的相互作用来调节的，而简化的2D细胞培养无法捕获这种复杂性。为了建立胶质母细胞瘤微环境的模型，使用脱细胞ECM墨水的挤压生物打印技术来创建胶质母细胞瘤细胞和内皮细胞的分隔区域，与混合共培养相比，它可以更好地模拟肿瘤-基质相互作用，并且可以复制临床观察到的患者特异性对治疗的抵抗力。在另一项研究中，通过使用明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）生物墨水的挤压生物打印技术开发了具有胶质母细胞瘤细胞和巨噬细胞分隔区域的小脑模型（图3B）。观察到胶质母细胞瘤细胞活跃地募集巨噬细胞进入肿瘤区域并将其极化为胶质母细胞瘤-巨噬细胞表型，这证明与临床产生的转录组数据相关。未来的研究可能会基于这些技术来整合其他血管，免疫和基质成分，以提供可预测的组织模型来剖析癌症微环境的多因素复杂性。
2.管状疾病模型
使用牺牲性墨水的3D生物打印方法提供了一种在3D水凝胶内部生成可灌注微通道的绝佳方法。尽管这些方法主要集中在工程组织上以进行植入，但仍有大量机会开发血管和上皮疾病模型。例如，牺牲性嵌入式印刷已被用于设计组织模型以研究溶质的重吸收和肾，肾小管与脉管系统之间的串扰，它们沿非线性路径紧密并置，这是一个困难的构造问题，值得进行生物印刷创新。使用牺牲性普朗尼克墨水，在纤维蛋白基质内印刷两个平行的微通道，并通过在一个通道中植入近端小管上皮细胞并在第二个通道中植入血管内皮细胞来生成上皮和血管单层（图3B）。使用闭环灌注系统控制通过通道的流量，以研究肾脏对葡萄糖从上皮通道向血管通道的重吸收，并且该模型能够概括内皮细胞功能障碍，并在高血糖疾病情况下增强重吸收。
3.纤维化疾病模型
在心脏，肝脏和肺部组织受到损伤后，不良的病理重塑可能导致无功能的纤维化组织的发展，从而破坏周围的健康组织并最终导致器官衰竭。工程化的组织纤维化模型可以为研究疾病进展或组织修复提供重要的机会。然而，使用传统的培养方法重建疤痕后出现的异质细胞和细胞外模式是具有挑战性的。为了建立肝纤维化模型，使用挤压生物打印技术来创建肝细胞，活化星状细胞和内皮细胞的结构化层。该模型表现出纤维化重塑的特征，包括胶原蛋白积累，细胞凋亡和肝功能降低，这归因于星状细胞群的存在，并且有可能使用靶向星状细胞激活的药物来减轻纤维化。
新兴的生物打印技术
尽管挤出生物打印是一种常见且可访问的生物打印技术，但在寻求生物学问题时可能还会使用其他相关技术。本节重点介绍已实施这些新兴的生物打印技术的示例，以及这些技术相对于挤出技术的优缺点（表2）。
立体光刻技术
通过将光聚集到2D平面中以局部固化水凝胶树脂来实现光刻，然后机械手将交联的层垂直平移以允许逐层依次交联成3D固体。根据光的传输方式，光刻存在几种形式-立体光刻（SLA）技术利用扫描激光束，而数字光处理（DLP）技术利用数字镜设备将光快速掩盖为2D模式。光刻技术可以创建10–μm范围内的物理特征，与挤出技术相比具有显着优势，挤出技术的最小分辨率为μm。此外，生物相容性光交联化学的发展使得能够设计能够支持高细胞生存力的水凝胶树脂（即生物树脂）成为可能。在挤出或光刻生物打印之间进行选择取决于所开发的细胞/组织模型。例如，与光刻系统相比，挤出生物印刷机相对便宜。另外，挤出生物印刷与多种生物油墨兼容，而光刻生物印刷仅与光可交联的生物油墨/生物树脂兼容。使用光刻方法制造异质结构也可能具有挑战性，因为在制造过程中无法轻松切换出生物树脂，从而限制了对共培养模型的适用性，尽管应该指出的是，最近已经开发出了新技术来解决这一限制。随着光刻技术变得越来越广泛和商业化，它们正越来越多地用于工程化组织和器官模型。但是，对光刻技术及其组件的步骤的详细描述不在本文的讨论范围之内。
有许多有趣的例子，其中光刻技术已用于制造载有细胞的结构或随后植入细胞以解决生物学问题的结构。例如，为了重现肝小叶的微结构复杂性，使用明胶生物树脂在仿生六边形微体系结构中使用DLP光刻在仿生六角微结构中对诱导的多能干细胞（iPSC）-肝细胞，内皮细胞和脂肪来源的干细胞进行图案化。与2D和3D对照相比，生物打印的三培养模型增强了肝细胞功能，并增加了肝特异性基因表达，白蛋白分泌和药物代谢酶。
光刻生物打印还可用于在3D水凝胶内部创建微通道，以创建分层的互连网络（例如毛细管床）。Grigoryan等利用光刻生物打印技术在合成水凝胶中设计了两个纠缠的明渠网络。第一个网络灌注了脱氧的红血球（RBC），第二个网络灌注了湿润的气态氧，导致RBC在流动过程中重新充氧。为了进一步证明这项技术的强大功能，作者对包含通气囊的血管化肺泡肺模型进行了生物打印，该模型由被灌注的血管床围绕着，以研究红细胞对气囊中的机械通气的氧化作用（图4A）。由于SLA和DLP光刻技术的逐层性质，特别需要较长的处理时间才能生成大体积，这是该技术的缺点。为了解决这一基本限制，最近开发了体积光刻技术，其中将光能从同时从多个角度传递的一组2D图像投影传递到材料体积（图4A）。从多个角度进行的附加光剂量曝光会导致3D能量剂量快速固化树脂体积。在一项重要的研究中，Bernal等人证明了该技术可用于生物打印目的，从而能够快速制造解剖形状和人类尺寸规模的载有细胞的结构。
图4新兴的打印技术
细胞球打印技术
高细胞密度构建体的印刷是重要的考虑因素，因为细胞很少以分离形式存在，并且由细胞间接触介导的协调的细胞集体过程是发育形态发生的基础。另外，当单个细胞分散在整个凝胶中时，如纤维化或癌症等许多疾病状态要忠实地概括，则具有挑战性。细胞自组织成微型球体或类器官结构，并已被生物学家使用多年，用于体外研究人类发育和疾病。特别是类器官模型由于其高细胞密度和支持发育样细胞分选和分化的能力而可以显示出新兴的生理结构和功能水平。但是，对自组织过程的控制有限，与天然器官相比，类器官具有非极化的结构不成熟的微体系结构。这导致了混合生物打印技术的发展，该技术能够将自组织的组织（通常是细胞球体）加工成3D构造以扩展和指导自组织。
该领域的早期工作表明，预先形成的球状体可以通过类似液体的聚结融合在一起，以最大程度地减少无胶粘剂的能量。为了将其缩放到生物打印过程中，将多个球体融合到组织链中，然后将链自动挤出成更大的3D结构。还开发了kenzan方法，其中将细胞球体串在支持的金属针上以融合成3D构建体，然后从针支架中移除融合的组织（图4B）。该系统可商购，并已用于制造各种不同的组织模型。最近，已经开发了基于水凝胶的球状生物打印技术，其中通过将未交联的水凝胶前体和球状体依次分层，然后将水凝胶层交联（图4B），将球状体打印到3D构建体中。这些系统避免了球体的机械破坏，从而可以在3D中进行精确定位，并改善了对几何形状和异质性的控制。为了研究旁分泌信号可以在ECM中传播多远，Ayan等人使用抽吸辅助生物打印技术以不同的分离程度（、和1,μm）在纤维蛋白水凝胶中打印内皮细胞球体。在高分离度下观察到有限的相互作用；然而，在更近的地方，观察到增强的EC发芽和毛细血管网络形成。
球形生物打印技术虽然没有像挤出生物打印那样广泛使用，但它对于开发器官和组织模型具有巨大的希望。例如，已经开发了多种种类的大脑类器官来模仿大脑的不同区域，并且两种类器官表型之间的简单融合已用于研究体外区域相互作用。球状生物印刷方法还可以提供一种强大的方法，将融合直接转化为更具仿生性的有机型组件。最后，人们对工程化血管化类器官的兴趣日益浓厚，以增强核心区域的氧气和养分输送，并为发育和疾病过程中的血管相互作用建模。为了促进将类器官放大到血管化3D组织中，数千种聚集体被卡在支撑模具中，以创建可自我修复的颗粒状组织基质，可支持可灌注血管通道的牺牲性嵌入式3D打印。胚状体，大脑类器官和心脏球体均与该过程兼容，血管通道的包含增强了组织核心区域内的细胞活力。应当注意的是，球状生物印刷具有相对较长的处理时间的局限性和印刷结构的复杂性的局限性。但是，与模仿组织样特征的高细胞密度有关，有许多好处。
生物打印在生物学中的应用前景
生物打印具有探索生物问题的巨大潜力，在这些问题中，传统技术不足以建立所需的复杂性和组织性，并且该技术在生物研究中的应用尚处于起步阶段。
远处的生化信号
“形态发生子”一词是计算机科学家艾伦·图灵（AlanTuring）提出的，用于描述形成跨越多个细胞长度的空间不均匀分布的因素，以指示不同水平的不同细胞命运。由于改变发育组织的空间特征的能力有限，因此了解体内形态发生梯度非常复杂。通过将工程或原发性组织源性吗啡“发送者”细胞与吗啡“受体”细胞并列放置，可能在周期性阵列中，生物印刷可以在其中发挥关键作用，将新兴的研究工作从2D扩展到3D环境。组织大小和组成，扩散距离和扩散/吸收率等问题非常适合于细胞工程学和生物打印方法的结合，可以定量控制这些变量。例如，挤压生物印记可用于创建细胞贮库阵列，从而能够组合筛选不同细胞群之间的旁分泌信号传导，例如血管与肿瘤细胞之间的相互作用（图5A）。诸如贮库间隔之类的参数可以在多种细胞类型之间变化，然后通过实时成像绘制出细胞结果（增殖，迁移，ECM分泌，蛋白质/基因表达）（图5A）。还可以对细胞进行工程改造，使其通过光或小分子触发信号传导或生化分泌，从而研究特定形态发生子如何以高度受控的方式影响旁分泌相互作用。
图5组织发育和体内平衡方面的生物学问题的生物打印方法
界面的构建结构
生物结构通常建立在具有不同特性和最终命运的细胞群体之间的界面上。整个发育时期的例子包括在胃形成过程中三个胚层（内胚层，中胚层，外胚层）的诱导和空间隔离，以及不同的早期胚胎结构（如神经管和体节）的自组织（早期体节）。控制界面结构形成的工程工作对于形成新的体外组织用于疾病建模和探索生物学问题至关重要。确实，单元在这些接口上显示了一系列动态范围，可以进行工程设计。这些动力学包括基于细胞-细胞粘附或细胞-ECM粘附特性的细胞分选，确定细胞的极性区分性（顶）和基（向下）方向，以及面内方向性（平面细胞极性）和集体迁移。界面的定位和界面处细胞的行为也可以通过细胞间或细胞ECM排斥/避免信号如Eph-Ephrin和Versican信号传导来完善。总体而言，这些集体细胞决定然后为组织的未来事件创造了“蓝图”。例如，平面细胞极性似乎在驱动上皮小管伸长和雕刻颅面软骨中起重要作用。这是通过设置定向的细胞分裂和细胞“插入”的方向来实现的，其中，成组的细胞相互调整其几何关系，以使其在一个方向上伸长，同时沿径向或正交方向收缩。此外，组织内的机械张力会反馈回平面细胞极性和定向细胞分裂。
这揭示了探索随时间推移图案化张力场对生物打印物体内的细胞集体行为的影响的机会。实际上，生物打印在这里起着独特的作用，因为将细胞放置在3D的合成界面上将开始创建生化-形态图，可用于研究组织界面（如神经）的发育（图5B）。3D生物打印可用于在支持性ECM水凝胶中连接两条细丝，并且可以更改一些参数，例如细胞类型（上皮，间充质），ECM类型（富含胶原蛋白/层粘连蛋白），细丝ECM力学（硬度，粘弹性），以及初始的丝几何形状（直线，弯曲）（图5B）。这些方法可用于研究集体细胞行为的局部差异如何产生内部张力和力，从而驱动界面处的形态变化，包括局部弯曲和屈曲（图5B）。
形状变化
通过插入和定向的细胞分裂，细胞片和小管的协调形状变化被界面处的一系列其他形状变化现象所补充。原则上，形状变化将伴随任何不能通过粘弹性耗散缓解的与界面平行的局部或整体机械应变（长度变化）。发育中的组织采用多种策略在界面处诱发应变，包括细胞片的顶端尺寸变化（顶端收缩）以及界面相对于组织的一个组织层的差异性生长，收缩力或机械约束。其他形状的变化也可以通过对液体状和固体状（堵塞的）细胞域进行适当的空间构图来实现（图5C），其中域的流动性与较低的细胞间粘附性相关，更高的细胞运动性和/或更低的细胞密度。生物打印方法可以帮助建立类液体状态与组织微环境的几何，机械和生化特征之间的关系。生物打印可用于创建具有细胞密度梯度的组织，以确定单独的细胞密度是否足以触发尖茎表型的形成，如果不是，则需要指定哪些其他微环境特征。例如，具有因细胞基质牵引而在高长宽比特征下出现的固有机械应力特征的工程组织可以在被认为可增强“尖端”细胞状态（例如神经胶质细胞源性神经营养因子）的生化梯度内进行模式化。这可以通过在细胞密度梯度附近对形态发生子的库进行模式化来实现，在广泛的微环境条件下对细胞迁移进行组合筛选（图5C）。这样的实验可以为设计生物打印的组织建立基本的了解，这些组织在体外进行例如程序化的分支形态发生过程。他们还将对新的类胚胎类器官的形状变化现象提供定量的理解。
总结
这篇综述概述了生物打印领域，描述了实现常用的挤压生物打印技术的步骤，并回顾了使用该技术解决生物学问题的示例。在某些情况下，此处提供的信息可以用作对简单结构进行生物打印的指南，而在其他情况下，与适当的工程师或直接与生物打印公司进行合作以帮助加快生物学家对生物打印的采用可能是有用的。
随着生物打印技术的发展，在生物学中使用生物打印的努力只会越来越多-从开发来模仿生物学动态特性的新生物墨水到与生物学复杂性相匹配的新生物打印机和生物打印方法。为了进一步增加广泛采用，工程师正在继续简化生物打印技术以改善自动化，以限制操作员所需的经验。例如，在机器和生物打印对象之间开发自动化的“中间打印”反馈机制可以使生物打印过程完全自动化。生物打印机还正在开发具有微流体挤出打印头的技术，该技术可以在打印过程中快速，平稳地切换不同生物墨水库，从而更容易概括天然组织和器官的生物复杂性。最后，带有平行喷嘴的挤压打印机也出现了，可以显着提高产量。
生物打印可能会取得进展的一个特定领域是形态发生，其中涉及复杂的细胞，生化和生物物理动力学，这些动力学雕刻出了活生物体及其组成器官的形状和组成。这些复杂性可以通过生物打印的构造以某种形式概括，包括与快速扩展的类器官工程领域合并。因此，生物打印的未来将为广泛的生物学问题提供巨大的潜力。
参考文献
AndrewC.Daly,MargaretE.Prendergast,AlexJ.Hughes,JasonA.Burdick,BioprintingfortheBiologist,Cell,Volume,Issue1,,Pages18-32