大家好，与大家分享一篇发表在Angew上的文章，文章标题为“ProteolysisTargetingChimera(PROTAC)forMacrophageMigrationInhibitoryFactor(MIF)HasAnti-proliferativeActivityinLungCancerCells”，该文章来自于格罗宁根大学FrankJ.Dekker课题组。文章主要讲述了由于巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）参与蛋白质与蛋白质的相互作用，而蛋白质与蛋白质的相互作用在炎症和癌症中起关键作用。于是该团队开发针对蛋白质-蛋白质相互作用网络的PROTAC，以便从其蛋白-蛋白相互作用网络中消除MIF。
导入
蛋白质巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)参与了癌症的发病。在多种癌症中检测到MIF的过度表达。并且基因敲除或基因敲除对MIF表达的下调不仅减少了肿瘤的进展和转移，而且还诱导了抗肿瘤免疫应答。这些结果表明，MIF的靶向可能是一种有希望的治疗方法。
MIF以均三聚体的形式存在，其中每个单体均由个氨基酸的肽组成。其主要通过与膜结合受体或细胞内信号转导蛋白的蛋白-蛋白相互作用来发挥其功能。这些受体之一是分化簇74（CD74），它是MIF的同源受体。MIF和CD74之间的相互作用触发了促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的激活并抑制了p53途径，导致细胞生长。此外，其他非同源结合伴侣如CXCR4在癌症发展中也起着关键作用。因此，发现干扰MIF和CD74或其他结合伴侣之间相互作用的试剂是抑制肿瘤生长的诱人策略。
除了具有细胞因子的功能外，MIF还具有酶促活性，可催化D-多巴色素和4-羟苯基丙酮酸（4-HPP）等底物的酮-烯醇互变异构。MIF通过其脯氨酸1发挥互变异构酶活性，脯氨酸1迄今为止，酶活性的生理功能仍然难以捉摸。与互变异构酶活性位点非常接近的一些关键氨基酸残基参与了与CD74和CXCR4的结合，这意味着MIF互变异构酶活性的小分子抑制剂能够干扰MIF-受体的相互作用。基于这一思想，已经开发出了一系列针对MIF互变异构酶活性的小分子抑制剂。最早发现的MIF抑制剂之一是ISO1（图1A），在MIF研究中已广泛用作参考化合物。
但是，ISO1对MIF的结合力仅在微摩尔浓度范围内。过去二十年的研究产生了数种具有纳摩尔浓度的MIF抑制剂。之前，我们的小组和其他小组报告了基于抑制剂2的7-羟基香豆素衍生物的构效关系（SAR）（图1A）。我们还发现含有7-羟基-3,4-二氢苯并恶嗪-2-酮骨架的化合物（例如3）也可以提供对MIF的有效抑制作用。在基于细胞的研究中，抑制MIF互变异构酶活性的能力并不总是与抑制MIF-CD74相互作用或MIF诱导的信号转导密切相关。可能不足以有效地干扰MIF蛋白质与蛋白质的相互作用。因此，我们寻求使用靶向蛋白水解嵌合体（PROTACs）作为替代策略来通过消耗MIF蛋白来减弱MIF功能。
PROTAC策略
PROTAC策略采用了一种异双功能分子，该分子与目标蛋白和E3泛素连接酶结合形成三元复合物（图1B），从而可以劫持E3泛素连接酶活性来泛素化目标蛋白，随后该蛋白被泛素蛋白酶体系统降解。感兴趣的蛋白质降解后，可以将PROTAC循环用于目标蛋白的新一轮靶向降解，从而提供催化循环。重要的是，PROTAC策略能够下调目标蛋白质的细胞间蛋白质水平，而不仅仅是阻止其各自的催化活性或相互作用表面之一。在由Crews和Deshaies小组开发后，通过确定有效的和选择性的E3连接酶配体，如pomalidomide4（图1C），PROTAC战略取得了巨大进展。
PROTAC设计和综合
化合物2和3（图1A）是具有纳摩尔效价的MIF互变异构酶活性抑制剂。基于源自晶体结构和对接研究的MIF互变异构酶抑制剂的已知药理学特征（图2），我们推测芳香族羟基官能团深深嵌入互变异构酶活性位点，在该位点中它与两个关键的氢键相互作用有关Asn97。因此，2中的甲氧基苯基官能团和3中的邻-二甲氧基苯基官能团突出并暴露于溶剂中。我们用胺取代了甲氧基官能团，以使酰胺化反应可连接连接基。MIF互变异构酶抑制剂2和3均用作PROTAC中MIF结合配体以降解MIF。将化合物2连接到E3连接酶配体泊马度胺以提供表示为组1的PROTAC（表S2），将化合物3连接到泊马度胺以提供表示为组2的PROTAC。
先前的研究表明，A细胞表达了高水平的MIF.此外，A细胞已成功用于评估基于cereblon的配体PROTAC的活性。因此，A是评估我们的推算性MIF靶向PROTACMD1-MD12对MIF蛋白最具影响的细胞系。随后，证明了MD13具有最高的结合常数以及纳摩尔级的降解效率。
MD13作为MIF定向PROTAC的特征
使用Western-blot研究了PROTACMD13介导的MIF降解对A细胞的浓度依赖性。MD13在纳米浓度下有效诱导MIF降解（图3A），并提供了nM左右的DC50和1微米以上浓度的90-95%左右的最大降解（图3B）。由ELISA测试测量的MD13的DC50约为nM（图3C），其与来自Western-blot的结果一致。通过比较MD13作为活性PROTAC和MD15作为非活性PROTAC来进行对照实验（图3D）。显示MD15无法降低MIF相对于控制的水平，这表明CRBN绑定参与了PROTACMD13的影响。
PROTACMD13降低A细胞MIF水平的能力
MIF降解的动力学提供相对快速的降解在3小时后可见，6小时后降解92%（图4A）。仅在48小时后观察到MIF水平的轻微恢复。与PROTACMD13和蛋白酶抑制剂Bortezomib的联合处理抑制了MIF的降解（图4B）。将具有MIF抑制剂3或CRBN抑制剂4的细胞预处理至三次E3连接酶的形成-MIF复合物从降解中拯救MIF（图4C）。PROTACMD13还提供在HEK细胞中活性，在nm浓度下诱导超过90%的MIF降解（图4D）。同时，结果显示MD13依赖于MIF的活性，CRBN作为蛋白酶活性，并且在低微摩尔范围内观察到近MIF降解，MD13的指标是潜在的MIF靶向PROTAC。
MD13的抗增殖作用
PROTACMD13有效降低了MIF水平，PROTAC用于验证MIF在A细胞增殖中的作用。作为第一步，使用MTS报告研究了MD13的*性，表明MD13在24小时治疗后浓度为20微米时不会抑制细胞活力（图S7）。我们随后评估了其对细胞增殖的影响，表明MD13抑制了A细胞在两个依赖性载体中的生长（图5A）。相比之下，灭活对照MD15至少不应抑制A细胞的增殖。MIF抑制剂3和CRBN抑制剂6也包括作为对照，其对浓度高达20微米的细胞增殖没有影响。同时，这些实验表明MIF靶向PROTACMD13抑制了A癌细胞的增殖。使用A癌细胞建立3D球体模型3D球体模型来研究长期MD13治疗在更复杂的肿瘤生长模型中的作用。通过测量直径来监测球状体的生长，并将其与治疗的第0天进行比较。与对照组相比，MD13治疗组的肿瘤球明显更小（图5B和图S9）。结果表明，在球形肿瘤模型中，MIF导向的PROTACMD13有效抑制A癌细胞的增殖。
MD13在细胞周期的G2/M阶段逮捕细胞
使用流动细胞仪进一步分析MIF靶向PROTACMD13对细胞周期进展的影响（图6）。我们的结果显示MD13在A细胞的G2/M期诱导细胞周期逮捕。相比之下，在MD15灭活对照的5微米范围内观察到对细胞周期的轻微或无影响。这些结果表明MD13诱导细胞周期进展抑制，这可能解释了观察到的细胞增殖抑制。
MD13抑制ERK信号
通过使用WB分析评估ERK磷酸化，研究了MIF导向的PROTACMD13处理对MIF相关信号通路的影响。24小时处理后，用2μmMD13处理证明可抑制A中ERK磷酸化约50％，并持续48小时。相反，与对照化合物3、4孵育24小时或MD15孵育6小时，24小时或48小时后，细胞的pERK水平没有明显降低（图7）。因此，用MIF导向的PROTACMD13进行治疗可抑制ERK磷酸化，这是MIF相关的信号转导事件。
总之，该团队发出了一种有效的MIF导向的PROTACMD13，它可以诱导A和HEK细胞中的MIF降解。MD13以时间，cereblon和蛋白酶体依赖性方式有效降低A细胞中的MIF蛋白水平。并证明了MD13在微摩尔浓度可以下抑制了A约50％的增殖。MD13处理也抑制了G2/M期的细胞周期停滞。MD13处理还抑制了ERK磷酸化，因此表明MIF降解还抑制了响应MIF信号传导并促进细胞增殖的信号传导途径。这项研究表明，针对肿瘤和其他与MIF相关疾病的MIF定向药物发现中，MIF导向的PROTAC是新颖的方式。
本文作者：GSH责任编辑：WSY原文引用：