本文来源：中国临床实用医学,,11(04):1-7.
DOI：10./cma.j.cn-0430-
本文引用：王晚萍,边海波,王夏珍,等.人表皮生长因子受体4在非小细胞肺癌中的表达意义及其对肺癌细胞生物学功能的影响[J].
摘要
目的
探讨人表皮生长因子受体4(HER4)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达意义及其对NSCLC细胞生物学行为的影响。
方法
选取年1月至年1医院呼吸与危重症医学科收治的经手术切除并经病理学证实的84例NSCLC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织，男55例，女29例，年龄(54.58±9.67)岁，年龄范围为33～75岁。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测肺癌组织和癌旁正常肺组织中HER4的表达，分析HER4与患者临床病理特征的相关性，通过Kaplan-Meier生存曲线分析HER4与NSCLC预后的关系。HER4-siRNA转染H细胞系沉默HER4的表达，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、侵袭小室(Transwell)法，流式细胞术检测细胞增殖、迁移和侵袭及凋亡情况。蛋白免疫印迹(Westernblot)检测HER4和间质上皮转化(EMT)相关蛋白的表达。
结果
NSCLC组织中HER4mRNA的表达水平(3.80±0.64)显著高于癌旁正常肺组织(2.07±0.57)，NSCLC细胞系H中HER4mRNA的表达水平(1.45±0.12)也显著高于人正常肺上皮细胞系BEAS-2B(0.78±0.06)，差异有统计学意义(P0.05)。将NSCLC患者按照HER4表达水平的中位值分为高表达组和低表达组，两组肿瘤淋巴结转移(TNM)分期、淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P0.05)。进一步采用Kaplan-Maier法分析两组生存函数，结果显示低表达组总体生存期为(40.14±2.58)个月，优于高表达组的(30.45±2.58)个月，差异有统计学意义(P0.05)。低表达组5年生存率[38.1%(16/42)]高于高表达组[23.8%(10/42)]，差异有统计学意义(P0.05)。HER4-siRNA及阴性载体转染细胞后，RT-qPCR检测发现，HER4-siRNA组中HER4mRNA的相对水平(0.52±0.04)低于空白组(1.00±0.01)和阴性组(0.96±0.06)，Westernblot检测显示，HER4-siRNA组中HER4蛋白表达水平(0.64±0.04)低于空白组(1.16±0.09)和阴性组(1.12±0.08)，差异有统计学意义(P0.05)。MTT试验结果显示，转染后，HER4-siRNA组H细胞的增殖活性低于阴性组和空白组，差异有统计学意义(P0.05)。Transwell法检测结果显示，与空白组和阴性组相比，HER4-siRNA组中迁移和侵袭的细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P0.05)。Westernblot检测结果显示，HER4-siRNA组上皮标志蛋白E-cadherin的表达水平显著高于空白组和阴性组，N-cadherin和Vimentin的表达水平则显著低于空白组和阴性组，差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞术结果显示，HER4-siRNA组中细胞凋亡率为(12.48±1.02)%，高于空白组(2.25±0.28)%和阴性组(2.69±0.35)%，差异有统计学意义(P0.05)。
结论
HER4可能是潜在的NSCLC预后和治疗的新的靶点。但关于HER4在NSCLC细胞的增殖、转移和凋亡中具体的作用机制，尚有待深入研究
非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)是肺癌的主要病理类型，占肺癌的80%～85%[1,2]。尽管肺癌的治疗手段在不断进展，但中晚期NSCLC患者预后情况仍不容乐观，5年生存率较低[3]。目前对于肿瘤标记物的探索仍是研究重点和热点。人表皮生长因子受体4(Humanepidermalgrowthfactorreceptor4，HER4)是表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族成员之一，能够与其配体结合，通过自身磷酸化参与细胞内信号传递，调节细胞的生长和分裂等。HER4在人类多种肿瘤的生长、进展及预后中发挥着重要作用。有研究表明，HER4是一种致癌基因，在肺癌、结直肠癌等组织中高表达，可能是恶性肿瘤的潜在治疗靶点[4,5,6]。但也有研究指出HER4在肝细胞肝癌等肿瘤的发生发展中发挥着抑癌作用[7]。因此HER4的作用目前仍存在一定的争议。本研究通过分析HER4在NSCLC中的表达，旨在探讨HER4在NSCLC发生及预后中的意义，并从增殖、迁移、侵袭及凋亡的角度探讨沉默HER4对NSCLC细胞的生物学功能的影响。现报道如下。
一、对象与方法1．对象：选取年1月至年1医院呼吸与危重症医学科收治的经手术切除并经病理学证实的84例NSCLC患者的肿瘤组织及癌旁正常组织，男55例，女29例，年龄(54.58±9.67)岁，年龄范围为33～75岁。纳入标准：(1)术前未接受肿瘤相关治疗者；(2)术后行常规辅助化学治疗者；(3)知情并签署知情同意书者。排除标准：(1)合并有其他系统恶性肿瘤者；(2)生存期小于3个月者；(3)术后随访或临床数据不完整者。对所有患者进行随访，随访时间截止至年1月。收集患者的一般临床资料，包括性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、肿瘤淋巴结转移(tumorlymphnodesmetastasis，TNM)分期、淋巴结转移等。本医院伦理委员会批准(批准号：)。
2．方法：(1)细胞培养和主要试剂。非小细胞肺癌细胞系H及人正常肺上皮细胞系BEAS-2B购自中国科学院上海细胞库。细胞常规培养于含有10%胎牛血清、U/ml青霉素(美国Gibco公司，批号)和μg/ml链霉素(美国Gibco公司，批号)的RPMI-培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。HER4小鼠单克隆抗体，N-cadherin兔多克隆抗体，E-cadherin小鼠单克隆抗体，Vimentin兔单克隆抗体，GAPDH小鼠单克隆抗体，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗小鼠或羊抗兔的免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)购自英国Abcam公司。(2)实时定量聚合酶链式反应(real-timequantitativepolymerasechainreaction，RT-qPCR)检测HER4的表达。采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号)提取NSCLC组织和细胞中的总RNA，并采用逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司，型号SuperScriptⅣReverseTranscriptase)参照该试剂盒说明书逆转录合成cDNA。根据Primer5.0的引物设计序列，HER4上游引物为5′-TTCAGGATGTGGACGTTGCC-3′，下游引物为5′-GCCTCCAGCACATTCTCGAT-3′；内参GAPDH上游引物为5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTCT-3′，下游引物为5′-GTCCTCAGTGTAGCCCAA-3′，由上海生工生物工程合成。采用SYBRGreen定量聚合酶链反应(quantitativepolymerasechainreaction，qPCR)SuperMix试剂盒(美国Invitrogen公司，型号Platinum?SYBR?GreenqPCRSuperMix-UDG)进行RT-qPCR，反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，40个循环；72℃延伸5min。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct计算HER4mRNA的相对表达量。(3)HER4-siRNA表达载体的构建及转染。按照siRNA设计原则，以DNA序列数据库中HER4基因mRNA序列(NM_.3)为模板，利用软件设计并筛选出特异性siRNA靶序列和1条非特异性阴性对照序列：HER4-siRNA，5′-CCTCAAAGATACCTAGTTATT-3′；阴性对照序列，5′-GCAAATCCCATGATTTACA-3′。由上海吉玛基因公司合成并构建HER4-siRNA表达载体。将生长良好的H细胞接种至6孔板中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞密度约80%时进行转染。严格按照lipofectamine试剂(美国Invitrogen公司，批号)说明书进行转染。将细胞分为空白组、阴性组和HER4-siRNA组，空白组细胞不作处理，阴性组细胞转染阴性载体，HER4-siRNA组细胞转染HER4-siRNA载体。qPCR检测HER4表达以验证转染效率。(4)蛋白免疫印迹(Westernblot)检测细胞内相关蛋白的表达。细胞转染48h后，分别收集各组细胞，加入μl含有0.1%苯甲基磺酰氟的放射免疫沉淀测定裂解液，4℃条件下，1r/m离心15min(r＝12cm)，提取细胞总蛋白。采用二喹啉甲酸法测蛋白浓度。三组分别取40μg蛋白样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。半湿法转膜后，采用含有5%脱脂奶粉的0.25%吐温-20的磷酸盐缓冲液溶液室温封闭1h。4℃孵育第一抗体过夜。HRP标记的IgG室温孵育1h，化学发光后显影。采用ImageJ软件对蛋白条带灰度进行定量分析，以得出目的蛋白的相对表达量。(5)四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)检测细胞增殖。转染48h后，将细胞以1×个/孔接种至96孔板，每组设置6个复孔。分别于24h、48h、72h时每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，孵育4h终止培养。弃去培养上清液，加入二甲基亚砜μl，震荡10min，在酶联免疫检测仪nm波长处测定各孔吸光度值，并绘制细胞生长曲线。(6)迁移小室(Transwell)检测细胞迁移和侵袭。Transwell上室预先用基质胶包被处理。将转染48h后的各组细胞用不含胎牛血清的RPMI-培养液重悬，以1×个/ml接种μl至Transwell上室中，下室加入含有30%胎牛血清的RPMI-培养基，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养24h。取出小室，PBS冲洗后，于无水乙醇中固定40min。结晶紫染色后，用棉签擦拭掉上室中未穿过的细胞，于倒置显微镜下观察，并随机选择5个视野计数穿过上室的细胞。迁移试验中Transwell小室不用基质胶包被，其余步骤均与侵袭试验相同。(7)流式细胞术检测细胞凋亡。将转染48h后的各组细胞分别接种于6孔板中，每组设置3个复孔。待细胞生长融合度约为90%时，收集各组细胞，PBS洗涤，制成细胞悬液。加入异硫氰酸荧光素标记的膜连蛋白V混匀，室温避光孵育15min，而后加入碘化丙啶，避光混匀孵育5min。采用CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司，型号CytoFLEX)检测细胞凋亡率。
3．统计学方法：采用SPSS21.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并用log-rank法比较患者的生存差异。P0.05为差异有统计学意义。
二、结果1．HER4在NSCLC组织和细胞系中的表达：NSCLC组织中HER4mRNA的表达水平显著高于癌旁正常肺组织，差异有统计学意义(P0.05)。NSCLC细胞系H中HER4mRNA的表达水平也显著高于人正常肺上皮细胞系BEAS-2B，差异有统计学意义(P0.05，表1)。
2．HER4与NSCLC患者临床病理特征及预后的关系：
将NSCLC患者按照HER4表达水平的中位值(2.76)分为高表达组和低表达组，每组42例，两组患者的年龄、性别、肿瘤大小、病理类型比较，差异无统计学意义(P0.05)，而TNM分期、淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P0.05，表2)。进一步采用Kaplan-Maier法分析两组生存函数，结果显示低表达组总体生存期为(40.14±2.58)个月，优于高表达组(30.45±2.58)个月，差异有统计学意义(P0.05，图1)。低表达组5年生存率38.1%(16/42)也显著高于高表达组的23.8%(10/42)，差异有统计学意义(P0.05)。
注：HER4为人表皮生长因子受体4
图1HER4高表达与低表达组的Kaplan-Meier生存曲线
3．转染后细胞中HER4的表达：HER4-siRNA及阴性载体转染细胞后，RT-qPCR检测发现，HER4-siRNA组中HER4mRNA的相对水平(0.52±0.04)明显低于空白组(1.00±0.01)和阴性组(0.96±0.06)，Westernblot检测也显示，HER4-siRNA组中HER4蛋白表达水平(0.64±0.04)明显低于空白组(1.16±0.09)和阴性组(1.12±0.08)，差异有统计学意义(P0.05)，提示转染成功干扰了HER4的表达。
4．沉默HER4对H细胞增殖、迁移和侵袭的影响：MTT试验结果显示，转染后HER4-siRNA组H细胞的增殖活性低于阴性组和空白组，差异有统计学意义(P0.05)，提示HER4-siRNA能够抑制H细胞的增殖。Transwell法检测结果显示，与空白组和阴性组相比，HER4-siRNA组中迁移和侵袭的细胞数量明显降低，差异有统计学意义(P0.05)。Westernblot检测结果显示，HER4-siRNA组上皮标志蛋白E-cadherin的表达水平显著高于空白组和阴性组，N-cadherin和Vimentin的表达水平则显著低于空白组和阴性组，差异有统计学意义(P0.05，图2)。该结果表明，沉默HER4能够抑制H细胞的迁移和侵袭，并影响上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)相关蛋白的表达。
注：MTT为四甲基偶氮唑蓝，EMT为上皮间质转化，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶，HER4为人表皮生长因子受体4
图2沉默HER4对H细胞增殖、迁移和侵袭的影响 A：MTT法检测H细胞增殖活性；B：Transwell检测空白组细胞迁移情况；C：Transwell检测阴性组细胞迁移情况；D：Transwell检测HER4-siRNA组细胞迁移情况；E：空白组、阴性组与HER4-siRNA组迁移细胞数；F：Transwell检测空白组细胞侵袭情况；G：Transwell检测阴性组细胞侵袭情况；H：Transwell检测HER4-siRNA组细胞侵袭情况；I：空白组、阴性组与HER4-siRNA组侵袭细胞数；J：Westernblot检测EMT相关蛋白表达；K：EMT蛋白相对表达量；与空白组和阴性组相比，aP0.05
5．沉默HER4对H细胞凋亡的影响：
结果显示，HER4-siRNA组中细胞凋亡率为(12.48±1.02)%，显著高于空白组[(2.25±0.28)%]和阴性组[(2.69±0.35)%]，差异有统计学意义(P0.05)，提示沉默HER4能够促进H细胞的凋亡。
三、讨论EGFR家族共包括4个成员，分别是EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3和HER4。该家族成员在多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的恶性程度、转移及预后密切相关[8]。目前针对EGFR和ErbB2的小分子抑制剂或单克隆抗体已经成功用于癌症患者的临床治疗[9]。HER4的异常表达和突变在肿瘤的发生发展中也得到了广泛的研究，值得注意的是，有研究指出，HER4是EGFR家族中唯一具有细胞生长抑制特性的成员[10]。Liu等[7]研究表明，HER4在肝癌中低表达，与肝癌患者的转移及不良预后密切相关，提示HER4具有抑癌作用；但也有研究证实，HER4在乳腺癌和胃癌等多种肿瘤中高表达，与患者的不良预后密切相关[11,12]；HER4在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为过程中发挥着重要作用[12,13]，提示HER4发挥着促癌作用。
目前关于HER4在肺癌中的作用也存在一定的争议。多数研究发现，HER4在肺癌组织中过表达，且HER4的过度表达与肺癌的淋巴结转移、TNM分期及患者预后不良有关[14,15]。但李明如等[16]研究发现HER4在肺腺癌组织中表达量低于正常组，HER4能够抑制肿瘤抑制因子TP53INP1的转录，且HER4高表达肺腺癌的预后相对较好，与大多数研究结果完全相反。本研究结果发现，HER4在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁组织，同时HER4的表达与肺癌的TNM分期及淋巴结转移密切相关；生存分析发现HER4高表达的患者预后总生存期较短，提示其与NSCLC预后不良有关。与上述大多数研究结果较为一致，同样证实HER4参与了NSCLC发生发展及预后，具有一定促癌作用。Rauf等[17]研究发现抑制HER4能够降低Wnt5A的表达，从而抑制肺癌细胞的生长，提示HER4可能是肺癌的潜在治疗靶点。Liang等[18]研究同样发现沉默HER4能够促进肺癌细胞A的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，同样证实其在肺癌的发生过程中发挥着致癌基因的作用。同时该研究也发现抑癌基因miR-a-3p在癌组织中低表达，且miR-a-3p能够靶向下调HER4的表达，抑制肺癌的发展。本研究同样采用siRNA技术沉默NSCLC细胞系H中HER4的表达，探究HER4在NSCLC发生进展中的功能作用。结果发现沉默HER4能够抑制H细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞的凋亡。EMT是肿瘤细胞浸润和转移的重要机制之一，其主要特征是Vimentin和N-cadherin高表达，而E-cadherin低表达[19]。本研究同样发现，下调HER4能够调控EMT标志物的表达，提示HER4可能通过调控EMT过程，促进NSCLC细胞的迁移和侵袭。
综上所述，HER4在NSCLC组织中表达上调，与NSCLC的发生发展及预后密切相关；沉默HER4能够抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，提示HER4可能是潜在的NSCLC预后和治疗的新的靶点。但关于HER4在NSCLC细胞的增殖、转移和凋亡中具体的作用机制，尚有待深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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