快速、准确的病原学诊断，能尽早选择敏感的抗感染药物或采取有效、具有针对性的防控措施，是感染性疾病精准化防治的核心。宏基因二代测序作为一种新兴的检测技术，能够不依赖微生物培养而检出临床样本中的所有微生物，该技术已在国内被广泛应用，并展现了其快速、无偏倚和高检出的优势。
《中国临床医学》杂志第27卷第4期特设立“感染性疾病精准诊治”专题报道，收录了医院“感染-感控-微生物”团队多篇相关文章，以8篇文章的全篇幅，整体展现了其在疑难复杂感染的病原诊断、医院感染防控中的意义。
SIFIC团队特此专栏报道，昨天已为大家带来两篇精彩文章，今天继续为大家带来《宏基因二代测序技术对慢性肺曲霉病病原学诊断的价值》，医院感染团队为我们解读二代测序技术在慢性肺曲霉病诊断中的应用，希望您能从中获益。
宏基因二代测序技术对慢性肺曲霉病病原学诊断的价值
作者：张尧，缪青，金文婷，史庆丰，苏逸，马玉燕，王青青，潘珏，胡必杰
单位：医院感染病科
目的：探讨宏基因二代测序(metagenomicnext-generationsequencing，mNGS)技术对慢性肺曲霉病(chronicpulmonaryaspergillosis，CPA)病原学诊断的价值。方法：回顾性收集年9月至年9月医院感染病科收治的78例疑似CPA患者病例资料，采集样本进行常规微生物学培养、血清烟曲霉特异性抗体IgG检测和mNGS，比较3种检测方法的灵敏度和特异度。根据诊断标准，将78例疑似CPA患者最终诊断结果分为CPA组(35例)和非CPA组(43例)。结果：以最终诊断结果为金标准，常规培养法、烟曲霉特异性抗体IgG检测和mNGS的灵敏度分别为28.6%、48.6%和65.7%，特异度分别为93.0%、90.7%和86.0%，其中mNGS的灵敏度显著高于常规培养法(P=0.)。ROC曲线下面积分别为0.、0.和0.。结论：在CPA的诊断中，mNGS的灵敏度显著高于常规培养法和烟曲霉特异性抗体IgG检测，且在检测时间上具有明显优势。宏基因二代测序技术；慢性肺曲霉病；诊断曲霉菌在自然界中分布广泛，人类往往通过吸入曲霉分生孢子引起感染。由于宿主免疫状态不同，曲霉菌可引起各种临床综合征，包括侵袭性肺曲霉病(invasivepulmonaryaspergillosis，IPA)、慢性肺曲霉病(chronicpulmonaryaspergillosis，CPA)和过敏性疾病等。近年来，由于器官移植患者的增加、艾滋病患病率的快速增长和广谱抗菌药物、免疫抑制剂、糖皮质激素和抗肿瘤药物的大量使用，肺曲霉病的发病率和死亡率有增高趋势。因此，早期识别和诊断此类疾病对改善预后具有重要意义。常规的CPA诊断主要通过从肺组织活检样本中检出曲霉孢子或菌丝作为确诊依据，或根据痰液、BALF等呼吸道样本的真菌培养结果进行诊断，但组织活检和真菌培养对检出肺曲霉病能力有限，且耗时较长。宏基因二代测序(metagenomicnext-generationsequencing，mNGS)技术作为一种新型的基因检测技术，理论上可快速、无偏倚地检测样本中所有病原体，包括细菌、病*、真菌、寄生虫等，特别适用于罕见的、新现的和非典型的病原体。研究表明，mNGS在病原体的早期诊断方面具有较高的敏感性，并且不受抗感染药物的影响，是感染性疾病可靠的检测手段。本研究回顾性分析年9月至年9月医院感染病科收治的78例疑似慢性肺曲霉病患者，采集样本进行mNGS、烟曲霉特异性抗体IgG检测和常规微生物培养，根据最终确诊结果评估mNGS在CPA诊断中的价值。1、资料与方法1.1研究对象回顾性分析年9月至年9月医院感染病科住院的78例疑似慢性肺曲霉病患者，同步采集样本进行常规微生物培养、血清烟曲霉特异性抗体IgG检测和mNGS，根据诊断标准确诊后分为CPA组(35例)和非CPA组(43例)。本研究经医院伦理委员会审核批准(No.B-R)，所有患者均知情并签署知情同意书。1.2CPA的诊断标准CPA的诊断包括确诊和临床诊断，确诊标准根据欧洲临床微生物与感染性疾病学会和欧洲呼吸学会发布的慢性肺曲霉病的诊断和管理指南以及美国感染病学会定义的诊断标准，同时满足以下条件。慢性肺部症状、慢性肺病或进展性影像学异常，如空洞、空洞周围浸润及真菌球；没有或轻度的免疫功能损害，通常有一个或多个基础肺疾病；曲霉IgG抗体升高或其他微生物学证据(如痰液、BALF或肺组织曲霉培养阳性、血清GＭ试验阳性、组织病理学见霉菌样菌丝)。临床诊断指满足诊断标准中的第1条和第2条，但无曲霉感染的血清学、微生物学或病理学证据，临床医生在排除其他疾病后做出诊断，并且抗曲霉治疗后患者症状有好转。1.3常规微生物培养法将收集到的痰样本按照微生物接种方法接种于沙保罗琼脂培养基，将BALF样本接种于沙保氏葡萄糖琼脂培养基，置于25℃和35℃恒温培养箱中培养2～7d，每天对菌落的形态和生长情况进行肉眼观察。1.4血清烟曲霉特异性抗体IgG检测采用酶联免疫法测定烟曲霉特异性抗体IgG，将稀释后的患者血清样本加到包被曲霉半乳甘露聚糖的酶标板中，血清中的曲霉IgG便与抗原结合，再加入抗人IgG酶标抗体和四甲基联苯胺产生显色反应，用酶标仪在nm波长下测定其吸光度，通过标准曲线计算样本中的曲霉IgG抗体浓度。烟曲霉特异性抗体IgG≥AU/mL，定义为阳性。1.5mNGS检测1.5.1样本处理和DNA提取取0.6mL呼吸道样本(痰液、BALF、肺组织匀浆)，经玻璃珠混合震荡后使用TIANampＭicroDNAKit(DP，天根生化科技有限公司，中国)试剂盒提取DNA。提取的DNA用作DNA文库构建。1.5.2文库构建和测序采用AgilentBioanalyzer质控文库插入片段大小，采用QubitdsDNAHSAssayKit(ThermoFisher，美国)质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制(RCA)生成DNB纳米球。制备好的DNB纳米球加载到测序芯片，采用BGISEQ-进行测序。1.5.3数据分析测序数据下机后去除低质量的和长度小于35bp的数据以获得高质量的数据。通过BＷA(