文章介绍
年1月，美国科研团队在期刊NatureProtocols（IF:14.）发表了一篇题为“Generationoflungorganoidsfromhumanpluripotentstemcellsinvitro”的文章。
#1
摘要
Abstract
肺上皮源于内胚层，经过一系列复杂的内胚层-中胚层介导的信号传导过程，最终形成有分支的传导气道（支气管、细支气管）和气体交换单元（肺泡）网络。这些阶段包括内胚层诱导、前-后和背-腹模式化、肺规格化、肺出芽、分支形态发生以及最后的成熟。在这里，描述了一个重现上述几个阶段的方案，以便将人多能干细胞（hPSCs）分化成腹侧-前肠球体，并进一步分化成两种不同类型的类器官：人肺类器官和芽尖祖细胞类器官。
生成的人肺类器官具有与发育中的人类气道支气管/支气管相似的细胞类型和结构，周围有肺间质和表达肺泡细胞标记的细胞。芽尖祖细胞类器官拥有一批高度增殖的多能细胞，具有体外多线分化潜能和体内移植潜能。
本文介绍的两种hPSC衍生模型已与人类胎儿组织进行了比对，结果表明它们具有人类胎儿样组织的代表性。因此，芽尖祖细胞类器官是探索上皮命运决定的理想选择，而人肺类器官则可用于模拟人肺发育过程中上皮-间充质交叉对话。除了在发育生物学中的应用，人肺类器官和芽尖祖细胞类器官还可用于再生医学、组织工程以及药物安全性和有效性测试。
#2
实验设计
Design
该方案的示意图如图1所示。对于本文所述的两种类型的类器官，该方案的前9d是相同的：首先用活化素A将hPSCs诱导到固有内胚层，然后通过SB-和NOGGIN分别抑制转化生长因子β（TGF-β）和骨形态发生蛋白（BMP）信号传导，同时激活WNT（CHIR-）、SAG和成纤维细胞生长因子4（FGF4）通路，将hPSCs诱导到前肠内胚层。前肠球体会自我组装，并可转移到Matrigel液滴中。在Matrigel中培养后，不同肺系的分化受生长因子信号环境的控制（图1）。用含有FGF7、CHIR-和ATRA的无血清培养基处理前肠球体，培养14天后就会产生芽尖祖细胞类器官。这一群体可以很容易地通过针传代进行扩增和维持，如果不传代，则会在培养约40d后产生具有近端-远端模式的肺上皮结构，并在芽尖处产生芽尖祖细胞群体。相反，用1%FBS和高浓度FGF10处理前肠球体约50d后，将产生包含胎儿气道样结构的人肺类器官，其周围有肺间质和肺泡祖细胞样细胞。从人肺部发育过程中鉴定出的特定mRNA和蛋白质标记物可用于确定细胞是否已按预期分化。
图1方案和时间表示意图。单层中的hPSCs在9-10d的过程中被诱导形成内胚层，然后是前肠内胚层。前肠球体自我聚集并脱离单层，漂浮在培养基中。然后将这些球体放入三维Matrigel液滴中培养，使其成为类似气道的人肺类器官或芽尖祖细胞类器官。
图2方案的应用。a-e，人肺类器官的潜在应用。a，类器官管腔可进行微量注射，如图所示，1μL4-kDaFITC-葡聚糖悬浮在PBS中，浓度为2mg/mL（绿色）。图片显示的是注射1小时后的类器官。b,人肺类器官可播种在生物工程聚乳酸-共聚-乙醇酸（PLG）支架上，然后移植到小鼠脂肪垫中。c,移植的人肺类器官含有气道样结构，8周后通过HE染色可观察到。d,移植8周后，人肺类器官（HLOs）含有NKX2.1+气道上皮结构，其人核抗原（HUNU）染色呈阳性，并表现出多纤毛细胞，其乙酰化微管蛋白（ACTTUB）染色呈阳性。.此外，这些结构包含上皮管，管的基外侧表面衬有P63+基底样细胞，假上皮管腔内侧衬有FOXJ1+纤毛细胞。e,将大约50个人肺器官样细胞播种到96孔板中的脱细胞人肺基质打孔器上。培养40d后，人肺器质体种子细胞产生上皮结构，表达多纤毛细胞标记物乙酰化微管蛋白和FOXJ1。f，芽尖原基类器官体可以用液体进行微量注射，这里使用的是1μL悬浮于PBS中浓度为2mg/ml的4-kDaFITC-葡聚糖（绿色）。共注射了5个类器官。图片显示的是注射1小时后的类器官。g，芽尖祖细胞类器官中的芽尖祖细胞能够多系分化为气道和肺泡样细胞，该系统可用于体外研究系决定的机制。芽尖祖细胞类器官单独用FGF7处理24天后产生的细胞表达AECI标记物HOPX和AECII标记物pro-surfactant蛋白C（PRO-SPC）和surfactant蛋白B（SFTPB）。肺泡样细胞约占这些类器官的50%。还生成了气道样细胞，包括对杯状细胞标记物MUC5AC和神经内分泌标记物染色质A（CHGA）及突触素（SYN）染色呈阳性的细胞。刻度线，50微米。i,芽尖祖细胞类器官可在培养液中扩增，并直接注射到受伤的小鼠气道中。在本实验中，芽尖祖细胞类器官由iPSC20-1tet-O-GFP细胞系产生，以提供强力霉素（DOX）诱导的GFP表达。类器官经生长、扩增和解离为单细胞后，将大约50万个芽尖祖细胞类器官细胞注射到用萘啶造成气道损伤24小时后的小鼠气道中。小鼠恢复期为6周。在细胞注射后的第五周，给小鼠喂食经DOX处理的水；存活的人体细胞可进入宿主血流，在接触DOX17后开始表达GFP。移植的细胞表达人类核标志物NuMA以及分化标志物，包括多纤毛细胞标志物（乙酰化微管蛋白）和小口细胞标志物MUC5AC。这些细胞与宿主上皮无缝整合。此外，细胞还能接收宿主血液中的信号，因为当宿主小鼠在饮用水中摄入DOX时，从tet-O-GFPiPSC株衍生的芽尖祖细胞就能开启GFP表达。
#3
时间安排
Time
培养皿涂层：1.25小时或过夜
步骤1-10，分离hPSC培养物：30-60分钟
步骤11-14，定向分化为内胚层和前肠前端球体：9-12d：4d内胚层最终分化，4-5d前肠前端内胚层分化
步骤15-19，收集漂浮的前肠球体：15-60分钟
步骤20A，生成人肺类器官：约50d
步骤20B，通过连续针传代产生芽尖原基类器官：约14-d（14d用于初始生长，多d用于维持和连续传递）
步骤20C，通过批量传代产生出芽、模式化的肺类器官：约6周
#4
预期结果
Results
在前肠分化的第四天，前肠球体应自行聚集、脱离单层并在培养基中自由漂浮。每孔中形成的球形体数量可能不同。一般来说，在前肠分化的第5天，单孔会产生大约-个球形。它们表现为不规则的小细胞团，表达NKX2.1和SOX2。
图5预期结果a.收集当天前肠球体的明场图像，在Matrigel液滴中培养。比例尺，μm。b,c，绝大多数前肠球形细胞为(b)NKX2.1+和(c)SOX2+。比例尺，50μm。人类肺类器官方案的预期结果。d，亮场图像显示人类肺类器官的预期生长模式。比例尺，μm。e，培养第天的HE染色显示，人肺类器官有持续存在的上皮结构和周围的间质。比例尺，μm。f，上皮结构包括P63+基底样细胞和有组织的气道样上皮。比例尺，50μm。g、间质周围平滑肌标记物平滑肌肌动蛋白(SMA)阳性，上皮结构基底外侧表面含有P63+细胞，管腔一侧含有FOXJ1+细胞。P63+细胞平均约占类器官内所有细胞的40%。虽然FOXJ1+细胞占HLOs细胞总数的5%，但未见成熟的ACTUB结构，第65天，85天罕见(数据未显示)。h，在第65天的HLOECAD+上皮结构周围的细胞中，多种间充质细胞类型标记物阳性，包括PDGFRα和vimentin(VIM)。i,HLOs内的罕见细胞表达SOX9和AECII标记物表面活性剂蛋白C(SFTPC)。这些细胞约占类器官内所有细胞的5%。j、HLOs内的罕见细胞表达SOX9和AECI标记物HOPX。这些细胞约占类器官内所有细胞的5%。k-m，芽尖祖类器官方案的预期结果，如果类器官是通过常规的针传代维持。k，上皮结构在培养第12天形成并可分离。l、培养第14天，95%以上上皮细胞为NKX2.1+SOX2+。比例尺，50μm。m，传代的芽尖祖类器官具有简单的上皮结构，由SOX9+SOX2+细胞组成，与妊娠第16周前的天然人肺芽尖祖相似。比例尺，50μm。n-r，芽尖祖类器官方案的预期结果，如果类器官不通过针通道维持，而是允许完整地生长成复杂的上皮结构。n、芽尖祖类器官随时间的预期生长模式。上皮结构可预见地在约3周时开始折叠，并在5-6周形成分支状结构。比例尺，μm。o，培养5d以上的明场图像，显示上皮芽结构的分叉。分叉的芽尖用星号标记。比例尺，μm。p，非针传代芽尖祖类器官的内部和芽尖区域的卡通表示。q，在这些结构的内部区域，大约5%的细胞表现出SCGB1A1染色，大约2%的细胞呈杯状细胞标记MUC5AC阳性。比例尺，50μm。r，这些结构的芽尖区域维持着芽尖祖标记物SOX9和前表面活性剂蛋白C(SFTPC)的表达。比例尺，50μm。
材料
生物材料
hESCs或hiPSCs。本方案可用于任何hESC或人类iPSC品系。我们已成功使用了H1、H9、UM63-1和UM77-1（美国国立卫生研究院登记号分别为、、和）等hESC细胞系。H9和H1细胞系来自WiCell研究所，UM使用的是iPSC细胞系20-1。根据我们的经验，源自亲本细胞系的转基因报告基因系与未转基因的对应细胞系（如H9mCherry和iPSC20-1TetO-GFP）表现一样好！注意应定期检查细胞系是否受到支原体污染，并通过细胞系鉴定方法（如短串联重复分析）进行检测，以确保细胞系身份正确。
试剂
细胞生长培养基和补充剂
基质、酶和其他试剂
设备
试剂设置
提取用于平板涂布的Matrigel以维持hPSC在4℃下解冻基质生长因子还原Matrigel（BMGF还原Matrigel）过夜。将BMGF还原型Matrigel分成制造商产品说明书上标明的等分试样（取决于批次）。产品规格表将提供各批次Matrigel的蛋白质浓度。将等分的Matrigel体积稀释到12mL冷DMEMF/12中时，可得到μg/mLhESC合格的GF还原Matrigel。12mLμg/mLMatrigel足够涂覆一个24孔板或两个6孔板。等分样品可在-80℃下保存6个月。
用基底膜生长因子还原的Matrigel涂覆培养板●设置时间15-30分钟；培养1小时至过夜六孔组织培养板涂覆一薄层Matrigel，以提高干细胞的粘附性。hPSCs的日常维护使用六孔板。在分化过程中，可使用24孔培养板，孔数可根据个别实验的需要进行调整。以下步骤说明了如何制备两个6孔板或一个24孔板。可在细胞传代前1小时制备平板，并将其置于室温（20-25℃）下的无菌罩中进行涂布，也可在细胞分裂前1周内进行涂布，并将平板用保鲜膜包好保存在4℃，以防蒸发。准备好涂布平板时，从-80℃中取出一份等分的基底膜生长因子还原Matrigel，放在冰上直至完全解冻。该等分量相当于将μg/mL蛋白浓度的Matrigel稀释到12mL液体中的体积。每个批次的hESC合格Matrigel都有制造商提供的蛋白质浓度。将解冻的基底膜生长因子还原Matrigel轻轻移入12mL冷DMEM/F12液体中。立即使用或在4℃下保存1周。解冻Matrigel时不要搅拌，以免过早聚合。在6孔板的每个孔中加入1mL稀释的Matrigel，或在24孔板的每个孔中加入0.5mL解冻的Matrigel。轻轻旋转或敲击平板，确保覆盖每个孔的整个底部。将平板在室温（20-25℃）下放置1小时后使用，或用保鲜膜包住平板边缘，在4℃下保存1周。
基底膜Matrigel应在-80℃下保存，使用前在4℃下解冻过夜。用DMEM/F12将基底膜Matrigel稀释至8.2mg/mL蛋白浓度。
关键：使用Matrigel时，请始终将其放在冰上，并快速操作。Matrigel会随着温度升高而开始凝固。
Dispase
用DMEM/F12配制5mg/mL的Dispase粉末溶液。在15mL锥形试管中加入2mL等分试剂，置于-20℃，可保存1年。当需要使用溶液时，将8mLDMEM/F12加入2mL等分的分散酶溶液中，以获得1mg/mL的工作浓度。在4℃下可保存1个月。
抗坏血酸
在50mL锥形管中，将mg抗坏血酸溶于10mL组织培养级无菌水中，制成50mg/mL的溶液。在组织培养罩中，使用0.22μm的Steriflip过滤器过滤该溶液。制作50μL的等分试样，在-20℃下保存一年。每次使用一个新的等分试样；解冻后的等分试样不要储存再用。
第2天使用的确定性内胚层分化培养基
将RPMI基础培养基中的HyCloneFBS稀释至0.2%（体积分数）浓度，用于第2天内胚层分化。要为一个24孔板的所有孔配制第2天的内胚层培养基，在12mLRPMI培养基中加入24μLHyCloneFBS。
用于第3和第4天的确定性内胚层分化培养基
将RPMI基础培养基中的HyCloneFBS稀释至2%浓度，用于内胚层分化的第3和第4天。在24mLRPMI培养基中加入μLHyCloneFBS，配制单个24孔板2天的基础培养基。两次使用之间在4℃下保存过夜。
前肠分化培养基
在无菌罩中将1×N-2、1×B27、10mMHEPES、1×GlutaMAX和1×pen-strep加入高级DMEM/F12中制成前肠基础培养基。4℃下可保存2个月。使用当天，加入10μMSB-、ng/mLNoggin、1μMSAG、ng/mLFGF4和2μMCHIR。加入生长因子和小分子后，当天使用，切勿储存。
人肺类器官培养基
使用当天，在前肠分化培养基中加入1%（体积分数）FBS和ng/mLFGF10。50mL足够一个24孔板使用约2周。在4℃下可保存2周。
用于生成和维持芽尖祖细胞类器官的完整培养基
当准备好生成或维持芽尖祖细胞类器官时，在芽尖祖细胞类器官基础培养基中加入适当的补充剂。要制作50mL容量的芽尖祖细胞类器官完全培养基，将50mL芽尖祖细胞类器官基础培养基放入50mL锥形管中，然后加入50ug/mL抗坏血酸和0.4μM单硫代甘油脂。这就是完全培养基。
然后加入3μMCHIR、10ng/mLFGF7和50nMATRA。50mL培养基足够一个24孔板使用约2周。在4℃下可保存2周。
表2
关于本研究中实验操作的具体步骤，小学社将在下期推文中为大家详细讲解！